摘要：该课题研究了一种新型雾化喷淋-立体通风的宰前静养装置对肉鸡夏季运输后肉质的影响。共分为以下2个处理:1)运输组(transport and rest, TR),45分钟运输,1小时休息；2)雾化喷淋-立体通风组(transport followed water-misting sprays and three-dimensional forced ventilation, TWFR),45min运输,15分钟雾化喷淋-立体通风，45分钟休息。与TR组相比,TWFR处理显著地提高了肉鸡的pH24值(24 小时)(P＜0.05)。TWFR处理也显著降低了鸡肉的滴水损失和蒸煮损失(P＜0.05),这种作用与明显降低的核磁共振T21弛豫时间和显著较高的拉曼光谱酪氨酸双峰(I850/I830)比值(P＜0.05)有关。TWFR和TR处理后的肉拉曼光谱的α-螺旋和β-折叠含量呈现显著差异(P＜0.05),这种差异可归因于宰前静养措施引起的蛋白质构象的变化。本研究表明,雾化喷淋-立体通风是夏季肉鸡屠宰中一种有效的肉质保证技术。

  关键词：核磁共振；肉鸡；拉曼光谱；雾化喷淋；立体通风；肉品质

  近年来，由于禽肉消费量的增加和深加工的即食食品的种类不断增多，对优质生鸡肉的需求逐渐增加。在影响禽肉品质的多种相互影响的因素中，肉鸡的宰前处理（例如，饲料戒断、捕捉、装箱、运输和静养）与死亡率、胴体降级和肉品质密切相关。宰前处理不当会对鸡造成严重的应激反应。应激反应与动物的行为、生理和情绪状态相关，它会感到某种情况对身体或精神状态的正常运作构成威胁。以屠宰前肉鸡的热应激为例，研究人员在宰前环境方面重视肉鸡夏季运输导致的应激。通过热暴露引起肉鸡宰前的热应激，进而导致肉鸡肌肉蛋白质的氧化稳定性降低，这可能是降低蛋白质机能的原因。

  通常，采用矿物质膳食替代品、喷水和通风来缓解动物饲养期间的高环境温度。为了减轻屠宰前的热应激，屠宰场配备了屋顶，保护禽类在静养期间免受阳光照射。其他解决方案，如水喷淋，也可以在屠宰前为动物营造舒适的环境，从而防止热应激。然而，水喷淋的单一处理不能有效地解决微环境中缺氧的问题，因为当进行喷淋时，装载鸡的运输车处于静止状态，而且这种普通的管道淋浴器给整个板条箱带来的水分布不均匀，有些鸡受到大量水喷淋，导致冷应激；同时其他鸡可能无法获得足够的水喷淋。作为应对不利的宰前热应激的策略，我们建造了一个新设施，即一个配备立体通风和雾化喷淋的封闭区域。该设施的特点是极小的液滴（直径约0.05毫米）、封闭空间内的三维立体通风，旨在缓解夏季运输后家禽的热应激。核磁共振（NMR）弛豫测量和拉曼散射光谱分别可以提供肉样品中水质子的迁移和肉蛋白分子中的肽链构象。本研究采用低场NMR和拉曼光谱的方法，观测夏季运输后雾化喷淋和立体通风对完整鸡胸肉品质的影响。

  1. 材料和方法

  1.1 材料

  该实验使用45天龄的混合性别的爱拔益加肉鸡。在32℃的环境温度和约2米/秒的风速下，将肉鸡从农场用卡车运输45分钟到屠宰场。肉鸡装在长75厘米、宽55厘米、高27厘米的板条箱中。一个箱子装7到8只鸡。鸡在箱子中的密度可保证空气流畅。每辆卡车的容量约为装2 500只鸡。抵达屠宰场后，5辆满载的卡车采用2种方法进行处理：1）休息1小时（TR），静养区域的休息温度为29℃，相对湿度为60％; 2）15分钟雾化喷淋立体通风和45分钟休息（TWFR）。每种方法都使用7只鸡。因此，总共70只肉鸡用于实验（5辆卡车，7只鸡×2种处理方法）。在封闭的棚屋中进行雾化喷淋立体通风。通过协调两个过程实现立体通风：1）用位于棚壁右侧和左侧的6个风扇供应空气; 2）用放置在屋顶上的风扇提供上升气流（图1）。用6个喷嘴完成雾化喷淋，喷嘴能在0.6 MPa的压力下进行0.05 mm的水雾喷雾。进行雾化喷淋立体通风的环境温度为26℃，相对湿度为70%。

  休息后，所有肉鸡被电击晕（15 V：交流电，750 Hz，每只10秒）并立即屠宰。宰后30分钟内，在4℃温度下取出两个胸大肌（PM）肌肉，放进实验室，在宰后24小时评估肉品质。

注：1.抽风机；2.喷头；3. 通风机

图 1：雾化喷淋和立体通风示意图

新型宰前静养装置；传统宰前静养装置；传统通风； 雾化喷淋+立体通风。

  1.2 pH值检测

  在肉匀浆中监测45分钟和24小时的鸡胸肉pH值。使用Ultra Turrax T25（IKA，德国），在含有碘乙酸钠（5mmol / L）和氯化钾（150mmol / L）的pH值为7.0的45mL冰冷的缓冲液中，以6 000 r / min的速度持续30 s，将约5g切碎的胸肉均质化。使用pH值计（FE-20，梅特勒-托利多仪器有限公司，苏黎世，瑞士）测定匀浆的pH值。

  1.3 滴水损失检测

  将每个肉样品修剪成特定的形状（1cm×1cm×3cm），然后在4℃温度下悬挂在气密容器盖子的钩子上24小时。滴水损失表示为与初始样品重量相比在24小时内重量减轻的百分比。

  1.4 蒸煮损失检测

  将PM鸡胸肌肉放置于薄壁塑料袋中，然后在80℃水中煮至内部温度达到75℃。 用可插入肉中的探针用数字温度计监测肉的内部温度。煮熟后，将袋子从水中取出，然后放在自来水下20分钟。从袋中取出肌肉，用滤纸使其干燥，然后称重。蒸煮损失表示为蒸煮前后的重量变化百分比，由3次重复的平均值计算得到结果。

  1.5 剪切力检测

  使用先前研究的改进程序测量剪切力。在获得蒸煮损失的测量值之后，然后将相同的肌肉用于蒸煮剪切力的测定。切下来自一个样品的3片肌肉条（20毫米×15毫米×5毫米）。将这些肉条称重，然后置于TA-XT2i上，该TA-XT2i配备有一个Warner-Bratzler剪切刀片（十字头速度为1mm / s）并横切纤维轴。计算并记录每条肌肉的平均剪切力（表示为克）。

  1.6 NMR弛豫时间

  根据以前的研究略微修改的程序进行NMR弛豫时间测量。从PM鸡胸肉切下约2克样品置于玻璃管（直径：15毫米）中，然后插入Niumag脉冲NMR分析仪的NMR探针中。检测采用32℃时22.6 MHz的共振频率和（0.5±0.08）T的磁场强度。使用Carr-Purcell-Meiboom-Gill序列测量横向弛豫（T2），τ值为200μs。获得12000个回波的数据，作为32次扫描重复。后续扫描之间的重复时间为6.5秒。通过在Multi-Exp Inv分析软件下应用多指数拟合模型来分析回波。记录3个弛豫时间（T21，T22和T23）。水分群（P21和P22）分别表示为峰（T21和T22）面积与总峰面积的比率。每次测量重复三次。

  1.7 拉曼光谱

  按照先前的研究方法稍作修改，对生肉和熟肉的样品进行拉曼实验。从PM肌肉切下约0.5g样品，用Jobin Yvon Labram HR800拉曼光谱仪在载玻片上铺展以进行拉曼测量。对每种类型的肉样品至少重复3次测量。得到的光谱在500至3 050 cm -1的范围内。每个肉样品的光谱在以下条件下获得：三次扫描，60秒暴露时间，2cm -1分辨率和120cm -1/分的取样速度，每1cm -1收集一次数据。使用Labspec 3.01c版对光谱进行平滑处理、基线校正，并相对于苯基丙氨酸带在1003cm -1处归一化。确定肉蛋白质的二级结构，并按照与文献中描述的相同标准从光谱中减去水谱后，表示为α-螺旋，β-折叠，β-转角和无规卷曲构象的百分比。

  1.8 数据分析

  使用SAS 9.2 for Windows进行描述性统计和单因素方差分析，显著性水平P <0.05，每只肉鸡的平均值作为重复。用邓肯的最小显著差异法确定不同处理方法的多重比较。

  2. 实验结果及探讨

  2.1 鸡胸肉的滴水损失、蒸煮损失，pH值和剪切力

  TWFR处理方法可以缓解生肉和熟肉的水分损失（参见表1）。TWFR处理旨在减少由宰前因素（如天气、运输时间和微环境）导致的肉鸡应激反应。夏季运输，特别是下午，对鸡热应激起着较大影响，可以使滴水损失和蒸煮损失分别增加1.04％和1.21％的水分损失。运输时间和温度增加了猪的热应激和肉质的敏感性。热应激可导致基因表达或代谢酶的生理变化。一项研究表明，鸡肝中的733个基因表达有差异;其中有些与能量代谢有关，而另一些则与免疫功能调节有关。作为一种重要的与肉品质显著相关的骨骼肌代谢酶，p-AMPK也因运输压力而发生变化。从实验设计的角度来看，剥夺宰前休息定会对我们的研究产生对比效果，然而，考虑到家禽加工业的实际应用，宰前不休息建议与动物福利的概念不一致，会使肉品质大幅下降。与TWFR处理肉相比，TR肉具有较高的滴水损失和蒸煮损失以及较低的pH值（P <0.05）。一些研究人员已证明低pH值与生鸡胸肉的持水能力差之间存在显著关系，最终肌肉pH值被认为在确定商业加工的肉鸡胸肉的持水能力方面发挥更大作用] 。质地软是鸡胸肉的缺陷之一，可能归因于高的宰后温度加上快速糖酵解和pH值从宰后45分钟到24小时的下降。我们的研究发现，TWFR处理可以提高鸡胸肉的剪切力（P <0.05）。这可能与TWFR组较低的pH值下降度相关。

表1  雾化喷淋立体通风对肉鸡运输滴水流失、蒸煮损失、pH值24h和剪切力的影响

  注：a，b表示在同一列中没有共同上标明显不同（P＜0.05）。TR是来自肉鸡的肉，运输时间为45分钟，休息1小时；TWFR是来自肉鸡的肉，运输时间为45分钟，随后是15分钟的雾化喷淋立体通风和45分钟的休息，下同。

  2.2 NMR弛豫时间

  图2显示了生肉和熟肉样品的分布式水质子NMR T2弛豫时间。以下称为T21，T22和T23的3个水分群成分在肉样品中检测，1 毫秒左右的次要成分，30至40 毫秒之间的主要成分，以及900至1700 ms之间的第3成分（参见表2）。并非所有3种水分群成分都可以同时显示在一个样品上，例如T23代表TR和TWFR肉，T21代表TWFR-C肉。我们样本的弛豫时间范围从不到1毫秒到近1700毫秒，与其他研究人员所涵盖的最小弛豫时间（小于1000毫秒）相比更大。根据峰值鉴定方面的文献，T21成分代表与大分子密切相关的水，T22成分代表肌原纤维内的水，T23成分对应于肌原纤维晶格外的水，即肉中额外的肌原纤维水。

  对于煮熟的样品，TWFR-C显示出比TR-C明显更低的T23弛豫时间值（P＜0.05）。核弛豫时间的减少意味着水的流动性降低。与TR肉相比，TWFR肉具有相当窄的T22峰宽（见图2）。TWFR肉的T22分布较窄可能是由于避免了严重的热应激，这可能导致肌纤维蛋白质的更大破坏。与普通肉相比，这种破坏导致横向肌丝收缩增加，表明肉系统水质子群的环境发生了明显变化。

  注：从上到下（T22）是TWFR，TR，TWFR-C，TR-C；TR-C煮熟的TR肉； TWFR-C是煮熟的TWFR肉，下同。

图2  运输后雾化喷淋立体通风对生鸡胸肉和熟鸡胸肉的T2弛豫时间分布的影响

表2  运输后雾化喷淋立体通风对T2弛豫时间的影响

  雾化喷淋立体通风后，与TR组相比，TWFR肉的结合水含量（T21）下降，相应的非流动水含量增加。该结果可归因于TR组肉的空间结构的适度变性和一定程度的膨胀。当然，这并不意味着从宏观角度来看TWFR组肉的保水性差。与T21状态水相比，T22状态水与宏观保水性密切相关，是最重要的研究对象。在TWFR上测定的T22分数多于TR，在TWFR-C上检测到的T22分数多于TR-C（参见图3）。更多的T22分数意味着肌原纤维内空间的肌原纤维内有更多的质子（主要是水）。与从TWFR肉获得的参数相比，TR肉的侧向肌丝间距的收缩导致T22群体的减少和T23群体的相应增加。与TWFR处理的肉相比，TR肉的侧向肌丝间距较小，因为pH值（5.74）降低了蛋白质之间的静电排斥，而TWFR肉的pH值（5.91）则远离肌原纤维蛋白质（pH值5.2）的等电位点。

图3  运输后雾化喷淋立体通风对峰面积比例的影响

  肉鸡热应激实验结果表明，氧化应激是肉鸡在高温环境下保护性的生理反应。例如，高温运输可以增加肉鸡的嗜异性细胞/淋巴细胞比率和血浆肌酸激酶活性，并减少嗜酸性粒细胞计数。这些保护性生理反应会影响鸡肉的品质，特别是保水性。处在高热环境中超过2小时后，肉鸡肌肉蛋白的氧化稳定性和蛋白质溶解度降低。夏季运输0.5小时导致保水性下降，并出现肉发白、发软和渗出性（PSE）。目前，在高温下运输应激的解决方案主要涉及在屠宰前调节肉鸡的食物，例如补充抗坏血酸、生育酚和牛至等，以提高肉鸡的抵抗力。我们对肉鸡水分状况的低场核磁共振的定量研究表明运输后雾化喷淋立体通风可提高非流动水的比例，从而提高肉品质。

  2.3 拉曼光谱分析

  TR和TWFR肉及其煮熟样品在500至3 050 cm-1区域归一化前的拉曼光谱如图4和图5所示。TR和TWFR肉及煮熟样品之间的拉曼带强度变化主要表明二级结构的变化和局部环境的变化。

图4  运输后喷淋通风对归一化前400-2000 cm-1区域拉曼光谱的影响

图5  运输后喷淋通风对归一化前2 800-3 050 cm-1区域拉曼光谱的影响

  2.4 二硫键的变化

  在肉类加工过程中，二硫键在蛋白质之间的相互作用中发挥重要角色，以实现肉蛋白质的功能。当C-C-S-S-C-C组的构象为“gauche-gauchegauche”时，含有胱氨酸残基的蛋白质和肽通常显示出接近510cm-1的条带。构象“gauche-gauche-trans”和“trans-gauche-trans”附加条带出现在分别为525和540cm-1 。 生肉拉曼光谱显示TR和TWFR分别位于532和530cm-1处的弱带（参见表3）。因此，这两个条带可以分配到gauche-gauche-trans构象。与TR相比，TWFR明显具有更高的强度（P <0.05）。加热后，对于TR和TWFR，该拉曼频带的最大强度向低频移动，这与热诱导带移结果一致。强度的降低可能表明gauche-gauche-trans构象转换为其他构象。

  2.5 本地环境的变化

  除了观察二硫键的变化外，芳香族氨基酸链还具有几个特征拉曼带（表3），其中一些可用于监测微环境的极性或参与氢键[18]。760cm-1附近的峰值强度的下降可能是由于Trp侧链的两亲性环境的变化。详细地说，Trp侧链的微环境从埋藏的疏水环境变为极性水溶剂，这种变化将进一步发挥蛋白质之间的疏水作用。760cm-1附近的拉曼光谱带的归一化强度表明TWFR低于TR（P <0.05）。然而，蒸煮后，TR-C和TWFR-C之间没有显著差异（P> 0.05）。因此，暴露的色氨酸可能在伴随夏季热应激产生的有害变化的蛋白质-蛋白质相互作用中起作用。

表3  运输后喷淋通风的拉曼光谱带归一化强度

  在差异光谱（855和828cm-1）中计算的酪氨酸双峰的强度比被认为是酪氨酸苯氧基组的氢键的良好指标。不同的条件，如暴露（0.9-1.45）或埋藏（0.7-1.0），可以通过这个比率确定。表3表明TR和TWFR肉的酪氨酸双峰（I850 / I830）比率均高于1.0，表明酪氨酸残基暴露并有能力参与中等或弱氢键结合。与TWFR肉相比，TR肉显示出明显较低的酪氨酸双峰（I850 / I830）比率（P <0.05）。这种减少可能表明，在类似PSE的肉蛋白中，较少的酪氨酸残基经受含水的或极性环境，与PSE肉样品的研究相同。当动物遇到代谢和生理紊乱时，氧化应激可能会损害免疫系统的保护屏障，并通过蛋白质改性（如羰基化反应）带来特定的持水能力品质特性。蛋白质氧化的体外实验研究表明，羟基自由基处理肌原纤维蛋白可导致肌球蛋白重链二硫键交联; Ca-ATP酶活性增加而K-ATP酶减少。这些活动表明，代表肌球蛋白的酶活性位点的硫醇基组已被修改。氧化还可以导致肌球蛋白的交联，蛋白质功能减少的氧化改性可以通过羰基反应进行[31]。该研究还表明，尽管TR和TWFR肉在蒸煮后没有区别（P> 0.05），宰前热应激可引起微环境（酪氨酸双峰）变化。

  2.6 二级结构的变化

  考虑到对涉及酰胺I带的肽键的氢键结合方案变化的敏感性，带波数的范围可用于估计蛋白质构造（α-螺旋，β-折叠，β-转角和无规卷曲）。通常，具有高α-螺旋含量的蛋白质表明以1 645-1 657cm -1为中心的酰胺I带，而β-折叠结构主要表明在1 665-1 680cm -1处的带。含有高比例未定义或无规卷曲结构的蛋白质具有接近1 660 cm-1的酰胺I带。

  可以根据从X射线晶体学获得的结构数据与拉曼酰胺I带的光谱参数之间的统计分析来执行蛋白质构造的定量分析。使用Alix方法的结构轮廓和二级结构百分比的结果如图6所示，用于未加热和加热的肉样品。与TR肉相比，TWFR肉具有不同的二级结构含量（P <0.05），TWFR肉由59.03％α-螺旋和16.54％β-折叠组成。与TWFR肉相比，TR肉显示出更高的α-螺旋含量和较低的β-折叠含量。加热后，TR和TWFR的α-螺旋部分趋于下降（P <0.05），同时β-折叠结构的增加（P <0.05）。通过酰胺III带振动光谱进一步证实加热后α-螺旋和β-折叠之间的这些转变。在肉煮熟之后，来自TR和TWFR样品的强度增加在1 232-1 240cm -1的范围内（参见图4）。加热后，TR和TWFR之间在α-螺旋部分的降低程度和加热后β-折叠结构的增加程度上没有差别。

图6  运输喷淋通风后由酰胺带估算的二级结构分数

  2.7 2800-3050 cm-1区域C-H拉伸振动的变化

  在2800-3050 cm-1区域中的拉曼光谱变化可能用于监测C-H拉伸。在2 940 cm-1附近C-H拉伸带的位置移动到更高的波数可能表明该带对微环境的极性和蛋白质变性的敏感性。图5显示了热处理后CH拉伸带的变化。对于TR和TR-C肉，拉伸带位置从2934略微移动到2936 cm-1，而对于TWFR和TWFR-C肉，拉伸带位置从2933 cm-1移向更高频率2934 cm-1。对类似PSE肉的研究也表现出相似的变化，这与蛋白质解折叠和疏水作用相关的脂肪族残基的微环境有关[5]。

  短时间内的急性应激促使肌肉代谢率的增加。这种快速糖酵解引起磷酸化酶变性与肌原纤维蛋白结合，从而产生苍白和渗出的特点。在这项研究中，拉曼光谱检测表明，雾化喷淋-立体通风夏季运输后对肉鸡蛋白质的二级结构和带位置移动的C-H伸展振动产生影响，为解决肉鸡夏季运输的热应激提供理论依据。

  3 结论

  总之，雾化喷淋立体通风可以提高鸡肉的保水性，分别表现为减少2.02％的水分损失和减少3.92％的蒸煮损失。进一步的低场NMR研究发现，保水性的改善主要是通过增加肉鸡在不易流动的水中的比例来实现的（T22）。拉曼光谱显示来自TWFR处理肉鸡蛋白质的α-螺旋（59.03％）较低，这意味着更高的蛋白质结构稳定性。

  

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