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动物源性食品中寄生虫的检测——棘球蚴
肉类食品网 http://www.meat360.cn 2021/7/15 10:09:20 关注：918 评论： 我要投稿
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棘球蚴是细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus）和多房棘球绦虫（Echinococcus multilocularis）的幼虫，可引起人畜共患寄生虫病———棘球蚴病（echinoclccosis），也称包虫病。棘球蚴寄生在多种中间宿主的内脏器官，压迫内脏器官引起被寄生的器官发生萎缩，进而引起相应的症状。成虫寄生在犬科动物的小肠中，幼虫可以感染多种哺乳动物，家畜中牛、羊、猪和骆驼均可感染，以牛和绵羊受害最重，人类也可以被感染。该病在世界范围内广泛分布，对人类和动物健康危害严重，在流行区造成严重的经济损失。
1 病原学特征
细粒棘球蚴（单房棘球蚴）为一独立包囊状构造，内含液体。形状不一，形状常因寄生部位不同而有变化，大小常从豌豆大到人头大。一般近球形，直径5～10cm。单房棘球蚴可分为三类：
（1）人型棘球蚴（echinococcus hominis） 囊包内含有液体，囊壁由两层构成：外层较厚，称角质层；内层很薄，称生发层。生发层上可长出生发囊，生发囊内壁上又可长出数量不等的原头蚴，有些生发囊脱离生发层，或有些头节脱离生发囊。游离在囊液中称“棘球砂”，肉眼检查棘球砂呈黄白色、如缝衣针针鼻大小。囊壁生发层上还可生长出第二代包囊，称作子囊。子囊可向原有囊包（又称母囊）腔中生长，称“内生性子囊”，也可向母囊外生长，称“外生性子囊”。子囊的生发层上还可长出孙囊，子囊和孙囊具有和母囊相同的构造，它们的生发层上长出生发囊，并形成头节。因此一个棘球蚴囊内可能包含着很多子囊和孙囊。此型多见于人，家畜中仅见于牛。
（2）兽型棘球蚴（echinococcus veterinarum） 其构造与人型基本相似，不同点是生发层上不再长出子囊和孙囊。此型在绵羊最常见。
（3）无头型棘球蚴（echinococcus acephalocysta） 其特点与上述各型完全不同，因囊内无生发层，不能长出头节、子囊和孙囊。此型最常见于牛。
多房棘球蚴特征是囊泡由许多小囊组成，呈桑葚状。
2 流行病学特征
细粒棘球蚴病（囊型棘球蚴病，CE）分布地区呈全球性，遍及世界五大洲，以牧区最多。非洲以肯尼亚、利比亚、突尼斯、阿尔及利亚和摩洛哥等国家为重。亚洲的中东地区以阿联酋、科威特、沙特阿拉伯、伊拉克和伊朗等国家为重，地中海东部的约旦、叙利亚和黎巴嫩等国家均流行棘球蚴病。南美洲疫情更重，见于阿根廷、巴西、智利、乌拉圭和秘鲁等国家。北美洲主要见于加拿大西北部和美国阿拉斯加州。欧洲多数国家存在棘球蚴病，但以西班牙、意大利撒丁岛和法国科西嘉岛流行较重。冰岛、塞浦路斯、新西兰和澳大利亚沿所马尼亚岛早年严重流行棘球蚴病，通过积极的综合防治措施，现已基本控制。我国以新疆为最严重，绵羊感染率在50%～80%，有的地区高达90.85%；其次在青海、宁夏、甘肃、内蒙古、四川等省份较严重。全国人体包虫病每年手术病例达2000例。近年在贵州、云南、东北三省、河南、山东、河北、安徽、广西、湖北、湖南等省份有散发病例报道。
多房棘球蚴病（泡型棘球蚴病，AE）分布地区较为局限，主要流行在整个北半球冻土带，尤以美国阿拉斯加州、日本北海道和西伯利亚一带为重，欧洲见于法国、德国等国家。我国多房棘球蚴病主要流行于甘肃、宁夏、新疆和青藏高原一带，东北和内蒙古有散发病例报告。
棘球蚴病是犬科动物与中间宿主之间传播的疾病，犬作为棘球蚴成虫的终末宿主在该病的流行上有重要的意义。终末宿主主要是犬，特别是野犬和牧羊犬。虫卵污染草原和生活环境，造成家畜和人的感染。细粒棘球绦虫的中间宿主范围广泛，流行病学上重要的是绵羊（成年羊），其感染率最高。棘球蚴病流行的传播途径以消化道途径为主，经口感染的方式有两种：一种是人体直接与感染棘球绦虫终末宿主动物频繁接触，造成误吞虫卵而感染。流行病学调查表明，棘球蚴病患病率与人群生活习惯有关。某些职业的人员感染率高，如牧民（尤其藏民）、饲养驯鹿者、儿童、学生、乳品厂工人、屠宰场人员、冷藏厂人员、牲畜皮毛加工厂或皮革厂工人、毛纺厂工人等，无论是棘球蚴血清学阳性率或患病率均相对较高。人体长期暴露在感染棘球蚴的环境中，可增强机体免疫力，因血中抗体增加而有利于防御棘球蚴感染。因此首次进入流行区后不久感染棘球蚴的新患者属于易感人群。另一种方式是间接传染，虫卵通过污染水源、蔬菜或瓜果等途径造成人体感染。另外虫卵亦可经呼吸途径吸入肺内，因此少数病例只有肺部感染而无肝部感染。
3 危害
棘球蚴寄生于人和猪、牛、羊等哺乳动物内脏及肌肉内，对人畜造成严重危害。棘球蚴对动物的危害严重程度主要取决于棘球蚴的大小、数量和寄生部位。主要危害是机械性压迫使周围组织发生萎缩和功能障碍。除此之外，各种动物均可因囊泡破裂而产生严重过敏反应，突然死亡，对人危害尤其明显。由于棘球蚴囊液中的棘球砂及破碎的生发囊均可在身体的任何部位长成新的棘球蚴，而且囊液对人和畜是异体蛋白，甚至含有毒素，囊泡破裂后引发人和家畜剧烈的过敏反应，造成呼吸困难、体温升高、腹泻，对人特别敏感。目前细粒棘球蚴病尚无有效治疗手段，主要通过手术摘除的方法控制病情；多房棘球蚴的危害远比细粒棘球蚴严重，预防与控制尤为困难。多房棘球蚴的生长特点是弥漫性浸润，形成无数个小囊泡，压迫周围组织，引起器官萎缩和功能障碍，如同恶性肿瘤一样；还可转移到全身各器官中，故有“虫癌”之称，给人群健康造成极大威胁。
4 国内外卫生要求
在检疫过程中，对检出棘球蚴的动物脏器应做销毁处理；肌肉中发现棘球蚴时，将患部割除销毁，其他部分不受限制利用；但若严重感染且囊泡破裂污染肉尸时，应高温处理后，做工业用。
5 检测方法
5.1 病原学检测
5.1.1 活畜检测
家畜轻度感染或初期感染都无症状。绵羊对该病最易感，严重感染时肥育不良，被毛逆立，易脱毛，肺部受累则连续咳嗽，卧地不能起立。牛肝脏受累时，营养不良，反刍无力，常臌气，体瘦衰弱，肺脏受累则咳嗽。严重感染时，病畜表现消瘦、咳嗽，右侧腹部膨大。
5.1.2 肉品检测
棘球蚴主要寄生于肝脏，其次是肺脏。肝、肺等受害脏器体积显著增大，表面凹凸不平，可在肝、肺中找到棘球蚴；有时也可在其他脏器如脾、肾、脑、皮下、肌肉、骨、脊椎管等处发现棘球蚴。切开棘球蚴可有液体流出，形成腔洞，将液体沉淀，用肉眼或在解剖镜下可看到许多生发囊与原头蚴（即棘球砂）；有时肉眼也能见到液体中的子囊甚至孙囊；偶然还可见到钙化的棘球蚴或化脓灶。棘球蚴原头节用0.1%伊红染色在显微镜下观察，可见外翻型或内陷型原头节，并可见顶突、小钩和吸盘等附件。棘球蚴的囊壁由内囊和外囊构成，前者为单细胞核层的生发膜和无细胞分层板状结构的角质层，外囊是宿主对棘球蚴反应产生的纤维性被膜和炎症细胞浸润。多房棘球蚴在显微镜下观察见由小囊泡群及其周围的纤维结缔组织被膜和炎症细胞浸润构成多房棘球蚴结节，多房棘球蚴增殖呈内殖性芽生和外殖性芽生，原头节通常罕见。
5.2 血清学检测
棘球蚴囊液已被作为人类囊性包虫病初级免疫诊断的一个主要抗原来源。但是该抗原缺乏敏感性、特异性，标准化困难，特别是与其他寄生虫感染者血清存在交叉反应。尽管根据这些抗原合成了重组蛋白，但是迄今为止，仍没有标准的高敏感性和特异性试验可用棘球蚴病的免疫诊断。目前常用的免疫诊断方法中，多数用透析棘球蚴囊液做抗原，也有用亲和层析和聚丙烯酰胺凝胶电泳方法来浓集和分离抗原的，活的或死的原头蚴都能作为有效抗原。其中动物和人均可采用皮内变态反应（卡松尼试验）诊断，敏感性高，但特异性差，一般准确率在70%左右，但是其操作简便、敏感性高，可以迅速测出反应结果，特别适用于大面积普查的初筛，目前仍然有实用价值。补体结合试验一般阳性率为50%～80%，有多种假阳性反应。棘球蚴的免疫血清学试验主要是间接红细胞凝集试验（IHAT）和ELISA，前者快速简便，检出率为83.3%；后者具有较高的特异性和敏感性。此外，还有酶联金黄色葡萄球菌A蛋白标记的酶联免疫吸附试验（PPA-ELISA）、斑点酶联免疫吸附试验（dot-ELISA）、生物素-亲和素酶联免疫吸附试验（ABC-ELISA）。张京元等对8种免疫诊断方法进行了比较，结果显示ELISA和ABC-ELISA敏感性最高，其次是IHAT，琼脂糖凝胶扩散最差。特异性以酶标记对流免疫电泳最高。由于这些试验均有不同水平的假阳性和阴性，因此建议以2～3种方法中出现阳性反应作为该病的诊断指标。实验室目前诊断依据囊肿的影像结构鉴定技术[超音波、电脑断层扫描（CT）、X射线]和免疫学诊断方法检测，主要是ELISA和免疫印迹，另外X射线、CT检出率较高。
5.2.1 dot-ELISA
Dot-ELISA是近年新发展的一种ELISA技术，选用对蛋白质有很强吸附能力的硝酸纤维素薄（NC）膜做固相载体，底物经酶促反应后形成有色沉淀物使薄膜着色，然后目测或用光密度扫描仪定量。Dot-ELISA可用来检测抗体，也可用来检测抗原，由于该法检测抗原时操作较其他免疫学试验简便，故目前多用于抗原检测。操作方法如下：
将待检血清作1:（1～20）稀释，用微量加样器将1μL血清点滴于硝酸纤维素膜（NC）上，置于70℃经1h将NC膜浸于1%BSA-PBS中，室温摇荡1h，洗涤2次，加1∶1000稀释的单克隆抗体（McAb）酶标记物，室温摇荡2h，洗涤3次后，加底物3，3′-二氨基联苯胺或4氯-1-乙萘酚，15min后，流水终止反应，以目视法判断结果。凡显示棕色斑点者为阳性，否则为阴性。以产生棕色斑点反应的最高稀释度为抗原滴度。
5.2.2免疫印迹
免疫印迹技术（immuno blotting，IB）是由十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、电泳转印及标记免疫试验三项技术结合而成的一种新型的免疫探针技术，是一种用于分析蛋白抗原和鉴别生物学活性抗原组分的有效方法，近年来已应用于检测寄生虫感染宿主体液内针对某分子量抗原的相应循环抗体成分或谱型，具有高敏感和高特异的特点。用于诊断的免疫印迹技术采用酶标记的探针（即二抗及其标记结合物），称酶联免疫电转移印迹（EITB）。具体操作步骤如下：
（1）样品分离 取新鲜棘球蚴按适当比例加缓冲液，匀浆，沸水浴2min，10000g离心30min，取上清液备用。抗原样品进行单梳SDS-PAGE电泳分离。左侧梳孔加标准分子量蛋白，梳孔右侧样槽加抗原液，电压控制在160～180V。
（2）电泳转印 从电泳板中取出已完成电泳的凝胶片浸泡于盛有转印缓冲液（TB）的搪瓷盘内。在TB内组成转印夹心板层：取相应大小的NC膜，徐徐浸泡在TB中，将凝胶片与NC膜光面紧贴。随后在凝胶和NC膜外侧的两面各放置浸湿滤纸两层而后海绵垫（厚0.5～1cm）一层，做好方位标记，最后夹于两层有孔塑料衬板之间，绝对避免各层之间留有气泡。将TB倒入转印槽中，然后插入转印板，使凝胶片位于阴极侧、NC膜位于阳极侧。置转印槽于4℃冰箱内，通电转印数小时或过夜，电流控制在250mA上下（40～50V）。
（3）探针检测 取出转印好的NC膜，水平地放入猝灭剂中，室温摇动1h以封闭未吸附蛋白质的区域，然后用洗涤缓冲液洗2～3次，每次30min以除去变性剂，使蛋白质的天然状态和生物学特性得以恢复。平置NC膜于浸有Tris-缓冲液（TBS）的滤纸上，用刀片将NC膜按电泳方向分割为宽约0.5cm的直条，用铅笔做好上端标记。取其中一张细条，并同标准蛋白质条带一起做氨基黑染色（也可用考马斯亮蓝染色或银染），测试分离效果并确定分子量位置。其余细条晾干后置4℃做印迹试验备用（抗原活性可保持3个月以上）。
（4）印迹试验 将上述抗原条置于分格反应板的反应槽内，正面向上，每槽一条，预先用0.05%TBS-吐温（TBS-T）液浸湿；被检血清用TBS-T液稀释（1∶150），加入反应槽中，以浸没膜条为限。通常需0.5～1.5mL，相当于10μL血样量（每槽加液量下同）；室温（20～25℃）振荡60min，用TBS-T洗6次，每次3min；加稀释好的羊抗人酶标二抗结合物，孵育1.5h，洗涤如上；加入新鲜配制的底物溶液；15min后用蒸馏水冲洗数次以终止反应，薄膜条取出置玻板上自然干燥；阳性反应可见蓝黑色（4-氯-1-萘酚底物）或棕褐色二氨基联苯胺（DAB）条带。
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| 文章作者：曲志娜 赵思俊等 中国兽医发布 文章编辑：一米优讯 |
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