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作为一种低脂肪、高蛋白的食品，牛肉深受消费者喜爱。其中，嫩度是影响消费者满意度和接受度的主要因素，也是衡量牛肉食用品质的关键指标之一。因此，国内外对肉嫩度变化机理的研究一直没有停止。综合学者的研究成果，可总结出影响嫩度形成的4 个主要机理：一是肌原纤维蛋白的碎裂或蛋白质结构发生改变导致Z线弱化；二是通过蛋白酶（钙蛋白酶、组织蛋白酶）和蛋白酶体裂解蛋白质引发嫩度变化；三是糖酵解酶在宰后调节嫩度；四是细胞凋亡和热休克蛋白参与嫩度形成。
宁夏大学食品与葡萄酒学院的马旭华、杨 波、李亚蕾*等主要采用4D-非标记定量（4D-LFQ）蛋白质组学技术筛选差异蛋白质，在贮藏0～8 d对秦川牛背最长肌的蛋白质组分进行检测，分析其涉及的信号通路，探索秦川牛宰后结构蛋白降解对嫩化机制的影响，以更加深入地研究剪切力、肌原纤维小片化指数（MFI）、肌肉总可溶性蛋白、肌原纤维蛋白、肌浆蛋白的变化机理。实验选用秦川黄牛背最长肌作为研究对象，秦川黄牛作为陕甘宁地区优势特色畜种，肉质细腻、瘦肉比例高、大理石纹路明显，其背最长肌可做成高档牛排。利用4D-LFQ蛋白质组学技术研究其嫩度变化机理，有望为秦川牛肉工业加工中对嫩度的控制提供相应的理论支撑。
1、不同贮藏时间秦川牛背最长肌剪切力的变化
由图1可知，0～8 d贮藏期剪切力总体呈先上升后下降的变化趋势，且上升的幅度小于下降的幅度。牛肉在贮藏0 d时的剪切力为（120.25±5.15）N，0～4 d时呈现上升趋势，4 d时最高，剪切力为（157.94±2.53）N；4 d后呈现下降趋势，8 d时达到整个贮藏期的最低点，剪切力为（93.41±5.08）N。
2、不同贮藏时间秦川牛背最长肌总可溶性蛋白含量的变化
由图2可知，0～8 d贮藏期总可溶性蛋白含量呈显著下降趋势（P＜0.05）。贮藏0 d时含量为（196.44±2.10）mg/g，贮藏8 d时总可溶性蛋白含量达到整个过程的最低点（（128.47±0.87）mg/g），总体下降了34.60%。这一结果表明秦川牛肉贮藏期蛋白质变化较为明显，宰后贮藏过程中肌肉组织进行代谢，氨基酸侧链基团的氧化修饰程度高导致蛋白质构象的变化加剧，从而使蛋白质分子内暴露更多的疏水基团，表面疏水性不断增加。同时由于游离巯基易氧化转化为二硫键，导致蛋白质大量聚集和沉淀，使肌肉组织蛋白发生降解。
由图3可知，秦川牛背最长肌条带众多，由此可判断蛋白种类较多。随贮藏时间延长，150～250 kDa内蛋白条带逐渐变窄；秦川牛背最长肌总可溶性蛋白100 kDa处I总条带逐渐变浅；37～50 kDa内蛋白条带逐渐变浅且分散；25～37 kDa内原肌球蛋白条带逐渐变浅，但II总条带显著变深；10～25 kDa内III总、IV总条带变深，IV总条带明显变深。总体上，高分子质量蛋白条带逐渐变浅，低分子质量蛋白条带逐渐变深，这一结果与总可溶性蛋白分析结果结合，可以推测出秦川牛背最长肌总可溶性蛋白出现显著降解现象，其结构总可溶性蛋白变化可能会影响嫩度的形成。
3、不同贮藏时间秦川牛背最长肌肌浆蛋白含量的变化
由图4可知，0～8 d贮藏期内肌浆蛋白含量呈上升趋势，由（43.48±0.43）mg/g增加至（52.97±0.35）mg/g，总体增加了21.83%。
由图5可知，0～8 d贮藏期I肌浆（150～250 kDa范围内两条蛋白条带）逐渐变浅；II肌浆（100 kDa蛋白条带）逐渐变浅变窄；III肌浆（37 kDa蛋白条带）由3 条蛋白条带逐渐变成两条，中间条带消失；IV肌浆（25 kDa蛋白条带）在前2 d逐渐明显加深，2～8 d贮藏期内变化不明显；V肌浆（15 kDa蛋白条带）在2 d后逐渐变宽，可能是大分子蛋白分解的结果；其他条带无显著变化。通过以上5 处条带的变化也可归纳出，高分子质量蛋白条带逐渐变浅，低分子质量蛋白条带逐渐变深变宽。可以推测出，贮藏过程中秦川牛背最长肌肌浆蛋白中高分子质量蛋白出现分解，含量变少，低分子质量蛋白种类逐渐增多，浓度不断增大。
4、不同贮藏时间秦川牛背最长肌肌原纤维蛋白含量的变化
由图6可知，0～8 d贮藏期肌原纤维蛋白含量呈下降趋势，由（136.72±3.06）mg/g持续下降至（67.60±0.84）mg/g。前期下降速率较快，后期下降速率有所放缓，总体下降了50.56%。
由图7可知，随贮藏时间延长，分子质量在100～250 kDa范围内蛋白条带逐渐变深，蛋白含量逐渐增多；分子质量在37～50 kDa内的蛋白条带变浅；分子质量在25～37 kDa内出现相对高分子质量蛋白条带变深、相对低分子质量蛋白条带逐渐消失或变淡；分子质量在15～20 kDa内的蛋白条带逐渐变深；10～15 kDa处随着贮藏期延长逐渐出现渐变蛋白条带。由以上蛋白条带变化可知，其发生降解的肌原纤维蛋白出现在37～75 kDa范围内，而其含量增加的肌原纤维蛋白出现在10～20、100 kDa以上范围内，总体变化较为显著，其变化可能会影响蛋白嫩度的形成。
5、不同贮藏时间秦川牛背最长肌MFI分析
由图8可知，秦川牛背最长肌在整个贮藏过程中MFI呈上升趋势，0～2 d和6～8 d贮藏期上升较缓，2～6 d时上升较快。贮藏0 d时MFI为28.50±5.16，之后MFI一直增加，贮藏8 d时达到整个贮藏过程的最高点（99.98±1.20），增长了250.81%。这一结果与李升升对牦牛平滑肌嫩度形成机理的研究中MFI的变化趋势相一致。
6、结构蛋白对宰后秦川牛背最长肌嫩化影响的机制分析
由表1可知，0～8 d贮藏期表征肌纤维降解程度的MFI与剪切力并无显著相关性（r＝-0.285），D’Alessandro等在牛肉嫩度研究中也出现相同结果。结合大量学者提出的嫩度形成与肌原纤维降解有密切关系，可得贮藏前期肌原纤维小片化程度增大，主要是能量与pH值的变化引起肌肉收缩、组织僵化，进而影响嫩度的降低，对剪切力影响较小。贮藏期内MFI逐渐升高，中后期肌原纤维小片化累积到一定量时对嫩度的形成有贡献。
由图9可知，贮藏0 d时测得秦川牛背最长肌肌肉中肌原纤维占比69.60%，肌浆蛋白占比22.13%，基质蛋白占比6.60%，符合肌肉组织中蛋白结构组成比例。此外，贮藏0～8 d肌原纤维蛋白所占比例呈持续减少趋势，由0 d时的69.60%逐渐降至8 d 时的52.61%；肌浆蛋白所占比例呈持续上升趋势，由0 d时的22.13%逐渐增加至8 d时的41.23%，但基质蛋白含量仅有少量变化。由此可得肌肉所含蛋白质中主要是肌原纤维蛋白的降解。而肌原纤维蛋白主要由肌动蛋白（45 kDa）、肌球蛋白重链（200 kDa）和原肌球蛋白蛋白（35 kDa）组成，由图7可知，0～8 d贮藏期肌动蛋白与原肌球蛋白所属条带呈显明显变浅趋势，可得肌动蛋白与原肌球蛋白发生降解，在31 kDa附近出现新条带有可能是肌动蛋白的分解产物，作为肌动蛋白降解标志物。对于肌球蛋白重链的降解情况，在总可溶性蛋白凝胶电泳图中发现在200 kDa附近条带变浅，但在肌原纤维蛋白电泳图中未发现有明显变浅的情况，由此无法判断肌球蛋白重链是否出现降解。肌原纤维蛋白降解可能是因为贮藏过程中受到内源酶（钙蛋白酶、组织蛋白酶、细胞凋亡酶）作用，同时微生物对肌肉污染和对蛋白质分解利用也有加速肌动蛋白降解的作用。
7、差异蛋白质筛选
实验中采用4D-LFQ检测了秦川牛宰后蛋白质组的变化，对所得的蛋白质二级结构进行质谱检索，共检索确定蛋白1 149 个，设置1.2 倍为标准差异倍数，共筛选出120 个符合标准的差异蛋白质，利用KEGG数据库对这120 种差异蛋白进行生物信息分析，所得的数据利用SPSS 25软件中Pearson相关性分析，共确定11 种差异蛋白质与嫩度形成机理有关，如表2所示。
8、生物信息学分析
图10是利用Cytoscape 3.6.1和String 10.0软件制作筛选出的与嫩度相关的蛋白质互作网络图。此网络图聚类系数为0.759，蛋白质相互作用（PPI）富集P值为1.0×10-16。ACTN1、MYH9、MYLPF、MYL12B、MYH13、MYL2、MYH6、ACTC1、TNNI1、TNNI2、MYH15的相互作用强烈。以上11 种蛋白在肌球蛋白结合、钙离子结合、细胞骨架蛋白结合的肌原纤维组装、骨骼肌组织发育过程等途径调控细胞的生理状态。
结 论
4D-LFQ蛋白质组学分析结果表明，贮藏0～8 d秦川牛背最长肌所含结构蛋白溶解度降低，蛋白质碎片从膜和肌纤维网络如肌纤维网络中释放出来，其中ACTN1、MYH9、MYLPF、MYL12B、MYH13、MYL2、MYH6、ACTC1、TNNI1、TNNI2、MYH15丰富度发生变化，相互作用强烈，在肌球蛋白结合、钙离子结合、细胞骨架蛋白结合的肌原纤维组装、骨骼肌组织发育、肌肉器官发育、横纹肌组织发育过程等途径调控细胞的生理状态，进一步说明贮藏期间，构成肌肉骨架的结构蛋白发生降解，影响肌肉收缩，引起肌肉僵直，从而造成肌肉剪切力增大、MFI增加，对秦川牛肉贮藏中后期嫩度的提高具有一定影响。
本文《宰后成熟期间结构蛋白对秦川牛肉嫩度的影响》来源于《食品科学》2022年43卷17期199-207页，作者：马旭华，杨波，李亚蕾，罗瑞明，张杏亚，张萌。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20210706-050。
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