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明胶质量分数和冷冻温度对培育肉多孔支架的影响


肉类食品网 http://www.meat360.cn 2024/6/20 9:33:17 关注:98 评论: 我要投稿

  肉类是为人体提供优质蛋白质和微量元素的重要来源。然而,全球肉类消费增长引发了发展传统畜牧业的问题,如环境压力、动物福利、食品安全和人畜共患病。因此,开发和研究新型肉类替代品势在必行。培养肉作为一种新兴技术,通过体外培养肌肉干细胞(muscle stem cells,MSCs)获得足够的细胞,而后细胞接触分化形成肌肉组织,取代传统畜牧业生产肉类。目前,开发低成本、高效、安全、工业化的培养肉仍然面临着多种挑战,其中体外3D培养MSCs分化为肌管是制约其关键因素之一。
  目前,3D细胞培养生产培养肉的方法多种多样,如3D打印、支架和微载体。其中,支架不仅提供了细胞黏附、生长和分化的场所以及肌肉组织生产的模板,还提供了营养物质和代谢物的运输。因此,构建一种具有合适孔隙结构、能够促进MSCs增殖分化并模拟传统肉类机械特性的支架势在必行。
  南京农业大学食品科学与技术学院、国家肉品质量安全控制工程技术研究中心、教育部肉品加工与质量控制重点实验室、农业部肉品加工重点实验室的Chen Yichun等根据物质质量分数和冷冻温度对MSCs三维培养支架的多孔结构进行调整,分析其力学特性,以阐明多孔结构对支架的影响。评估MSCs在支架上的增殖和分化情况,筛选不同条件下制备的支架。通过比较培养肉与天然猪肉的力学特性验证模拟的肉质,旨在为生产培养肉的高效支架提供理论基础。


  图1  不同孔隙结构支架的制备和应用示意图
  表1  基于不同明胶质量分数和冷冻温度制备多孔支架


  -30、-80 ℃时,支架孔隙形状为不规则多边形,液氮下支架孔隙较窄,有较长的凹槽。低温和高质量分数明胶可以减小支架的孔径。随着明胶质量分数的升高和冷冻温度的降低,支架孔隙率逐渐降低。在-30、-80 ℃和液氮条件下,3%明胶支架的孔隙率分别高于该冷冻温度下6%、9%明胶支架。相同明胶质量分数下冷冻处理的孔隙率无明显差异。


  a. 扫描电镜图像(比例尺=100 μm);b.孔隙度;c.孔隙分布。
  图2  不同孔隙结构支架的显微结构特征
  随着明胶质量分数的增加或冷冻温度的降低,支架的抗压强度和抗压模量均增强。在相同明胶质量分数下,支架抗压强度随冷冻温度降低而增加,但无显著差异(P>0.05)。而在相同冷冻温度下,随着明胶质量分数的增加,支架的抗压强度显著提高(P<0.01)。


  a.抗压强度;b.抗压模量。
  图3  不同孔隙结构支架的力学特性
  MSCs在各支架组的钙黄绿素乙酰氧基甲酯染色显示出良好的活性。继液氮下制备支架的局部排列,MSCs沿孔隙结构排列。该条件下制备支架上培养的MSCs比其他2 种温度下制备的支架更窄、更长。此外,在-80 ℃和液氮条件下制备的6%明胶支架中,细胞增殖第2天的细胞计数均高于3%和9%明胶支架。


  a. 钙黄绿素乙酰氧基甲酯染色的MSCs图像(比例尺=250 μm);b.荧光培养MSCs 2 d后的细胞计数。
  图4  MSCs在不同孔隙结构支架上的增殖情况
  不同孔结构支架上的纤维状肌动蛋白(fibros actin,F-actin)细胞骨架均可检测到明亮的荧光。3%明胶支架上的F-actin荧光强度弱于6%和9%明胶支架。3%明胶支架内、外均有短而稀疏的微丝分布,-30 ℃时尤为明显。在-80 ℃液氮条件下制备的6%明胶支架上培养的MSCs可观察到F-actin聚集和MyHC明显表达。与-80 ℃相比,液氮制备的3%、9%明胶上培养MSCs的肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MyH)荧光面积更大。结果表明,6%明胶支架具有适合MSCs迁移和扩散的孔隙结构和机械强度。


  a. MSC的荧光染色(比尺=200 μm);b. MyHC荧光面积定量。
  图5  不同孔隙结构支架上培养的MSCs分化情况-80 ℃培养MSCs的肌细胞生成素(myogenin,MyoG)和MyHC的表达高于其他2 组。由于-80 ℃、6%明胶制备的支架具有较高的孔隙率和合适的孔径,在第12天的成肌相关基因表达量高于其他2 种温度制备的支架。结果表明,-80 ℃、6%明胶制备的支架相对更适合MSCs分化。


  a. MyoG基因表达水平;b. MyHC基因表达水平;c.肌细胞生成素和肌球蛋白表达;d. 肌细胞生成素条带灰度分析;e. 肌球蛋白条带灰度分析。
  图6  MSCs在不同孔隙结构支架上培养的基因和蛋白表达分析

    本研究对不同冷冻温度和明胶质量分数下支架的多孔结构进行调整。具有合适多孔结构的支架既为MSCs的增殖分化提供了适宜的微环境,又保证了营养物质的充分运输。此外,合适的多孔支架可以提供与传统肉类相近的力学特性。在设计培养肉支架时,需要充分考虑机械特性和多孔结构之间的平衡。本研究为开发合适的多孔支架用于培养肉的生产和可扩展性提供了新的研究思路。

  文章链接:
  https://doi.org/10.1016/j.fbio.2024.104343

文章来源:肉类研究     文章作者:南京农业大学李春保教授、周光宏教授     文章编辑:一米优讯     
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