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摘要：20世纪90年代，本实验室从云南省哨兵动物采集的血液中分离到7种血清型蓝舌病病毒（bluetongue virus，BTV）。但这些毒株的遗传特征至今仍不清楚，因而阻碍了我国的BTV演化历史分析。为掌握云南省早期流行BTV毒株的遗传特征，对1995—1997年云南省分离的25株BTV毒株的基因组节段2、3、7和10（Seg-2、-3、-7、-10）进行一步法RT-PCR扩增、测序以及序列分析。Seg-2序列分析显示，1995—1997年云南省分离到的7种不同血清型（BTV-1、-2、-3、-4、-12、-15、-16）BTV毒株，分属A、B、G、H、I和J等6种基因型；BTV-12型毒株的Seg-2为西方地域型，其余毒株的Seg-2则属于东方地域型；Seg-3和Seg-10序列分析显示，25株BTV毒株均为东方地域型；Seg-7序列分析显示，1株BTV-2型、2株BTV-12型和1株BTV-16型毒株属于西方地域亚型，并与南非和荷兰BTV毒株的Seg-7具有最近的亲缘关系，其余毒株则均为东方地域型。上述结果表明，云南省存在多种血清型BTV的流行，而Seg-2和Seg-7基因重配毒株的发现，提示国外的西方地域型毒株已侵入云南省，并在传播过程中与我国毒株发生了基因重配。本研究为我国BTV的演化分析与溯源研究提供了数据参考。
蓝舌病（bluetongue，BT）是一种由蓝舌病病毒（bluetongue virus，BTV）感染引起的烈性出血性动物疫病。BTV主要通过库蠓属（Culicoides spp.）雌性昆虫的吸血叮咬传播，能够感染牛、羊、骆驼和鹿等多种家养及野生反刍动物。BTV感染绵羊后可引起较高的发病率和病死率。而牛和山羊感染BTV后往往无明显的临床症状，在BTV传播过程中扮演了病毒储存库角色。据统计，BT对全球畜牧业生产每年造成约30亿美元的经济损失，因此被世界动物卫生组织（OIE）列为须通报动物疫病。
BTV属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）环状病毒属（Orbivirus），其基因组由10条（genomic segment 1~10，Seg-1~10）双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）片段组成，可编码7种结构蛋白（VP1~7）和5种非结构蛋白（NS1~4以及NS3a）。Seg-2/VP2是BTV变异程度最高的成分。VP2能够诱导被感染动物产生特异性中和抗体，对病毒血清型（serotype）具有决定性作用。2008年至今，世界范围新发现了4种BTV新血清型（BTV-25~28）。因此，BTV血清型由过去的24种增加至28种（BTV-1~28）。
虽然VP3序列在BTV毒株间高度保守，但编码该蛋白的Seg-3序列随BTV毒株流行地域不同而出现差异，因此可以根据其序列差异，将世界范围内BTV毒株划分为东方（Eastern）和西方（Western）两种主要的地域型（topotype）。与VP3类似，VP7和NS3蛋白的保守程度也较高，其编码节段Seg-7和Seg-10的序列变异也与BTV毒株流行地域密切相关，可根据Seg-7和Seg-10的序列差异，将世界范围内BTV毒株分为东方和西方两种主要的地域型以及数种地域亚型。Seg-3、-7和-10序列具有强烈的地域特征，因此进行上述基因组节段序列分析，能够为追溯病毒起源提供依据。
我国1979年首次在云南省师宗县绵羊中记录了BT的暴发。之后，湖北省、安徽省、四川省和山西省相继暴发BT，并陆续分离到BTV-1、-2、-3、-4、-12、-15和-16型毒株，其中BTV-1和BTV-16型在我国流行广泛，并且都能够导致绵羊出现较明显的临床症状。2012年以来，在国家公益性行业（农业）专项资助下，云南省畜牧兽医科学院在云南省、广西壮族自治区、广东省、湖北省、江苏省、山西省、新疆维吾尔自治区和内蒙古自治区等8个省份设立哨兵动物，共分离到12种血清型BTV毒株（BTV-1、-2、-3、-4、-5、-7、-9、-12、-15、-16、-21和-24）。
多种血清型BTV在我国广泛流行，不同血清型毒株间缺乏交叉保护，病毒通过突变和基因重配，不断产生变异毒株，这些都为当前的BT防治工作带来了挑战。对我国不同历史时期的BTV流行毒株进行序列比较分析，有助于掌握BTV的演化特征以及我国 BTV流行毒株的溯源分析。虽然本实验室已经完成了2012年以来我国不同血清型BTV分离毒株的全基因组测序，但对1995—1997年云南省BTV流行毒株的遗传特征尚不清楚。因此，对1995—1997年分离自云南省分属7种血清型的25株BTV毒株的Seg-2、-3、-7和-10基因节段进行了扩增、测序和遗传特征分析，以期为我国BTV的演化分析与溯源研究提供科学数据。
材料与方法
细胞、毒株和病毒培养
幼仓鼠肾细胞（baby hamster kidney cells，BHK-21），由本实验保存；25株BTV毒株，1995—1997年分离自云南省师宗、芒市、景洪、峨山等地设立的哨兵牛，病毒分离信息见表1。将分离的BTV毒株接种BHK-21细胞，当细胞病变（cytopathic effect，CPE）达到90%时刮下细胞，4℃ 8000r/min离心15min，弃去沉淀，将病毒液分装，-80℃保存备用。
引物设计与合成
根据GenBank中公布的BTV毒株序列，采用Oligo 7.0软件设计10对引物，分别用于扩增7种BTV血清型毒株的Seg-2、-3、-7和-10（表2）。以聚碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）处理水稀释至终浓度为10μmol/L备用。
RT-PCR扩增与测序
采用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒抽提病毒核酸，将核酸于94℃变性3min后，立即冰浴。分别取5μL变性核酸为模板，使用表2中的引物对，采用一步法RT-PCR，对BTV分离毒株的Seg-2、-3、-7和-10进行扩增。利用Universal DNA胶回收纯化试剂盒，对PCR产物进行电泳胶回收，以PCR扩增的上、下游引物作为测序引物，对纯化的DNA进行双向测序。
序列分析与系统发生树构建
使用DNAstar软件（Ver 6.0），对测序结果进行序列拼接组装；利用MEGA 6.0软件，进行序列比对分析。采用最大似然法（maximum likelihood，ML）构建系统发生树：Seg-2序列选择“GTR+G”模型，Seg-3序列选择“TN93+G+I”模型，Seg-7序列选择“GTR+G+I”模型，Seg-10序列选择“T92+G”模型，自举检验（bootstrap）取值1000。序列相似度，以平均数（mean）表示。本研究中获取的序列以黑色菱形符号表示。系统发生树中其他国家分离的BTV毒株序列以“GenBank序列号_BTV血清型_分离国家_病毒分离时间”表示。
结果与分析
Seg-2、-3、-7和-10的RT-PCR扩增
设计10对引物（表2），对分离的25株BTV毒株Seg-2、-3、-7和-10进行一步法RT-PCR扩增。结果显示，7对针对不同血清型Seg-2的引物均能够特异性地扩增出大小约为1200bp，与预期大小相符的DNA片段，而针对Seg-3、-7和-10的3对引物，也能够特异性扩增出大小分别为1100、1100和800bp，与预期大小相符的目的DNA片段。
Seg-2序列分析
序列比对分析显示，云南省1995—1997年分离的25株BTV毒株分属BTV-1、-2、-3、-4、-12、-15和-16型等7种血清型。世界范围内27种血清型（BTV-1~27）BTV毒株的Seg-2可分为12种基因型（Nucleotype A—L）。在系统发生树上，本研究中的25株BTV Seg-2与对应血清型BTV参考毒株聚为一簇，分属A、B、H、I、G和J等6种基因型，与对应血清型BTV国际标准参考毒株的Seg-2序列相似度大于68.10%，VP2序列相似度大于75.00%（图1~2），表明早期通过血清中和试验对BTV血清型鉴定结果的正确性。云南省分离的同一种血清型BTV的Seg-2/VP2序列高度相似，Seg-2核苷酸序列相似度在92.80%~100%之间，VP2氨基酸序列相似度在96.90%~100%之间（图2），表明云南省流行的同一血清型BTV的Seg-2有着最近的共有祖先。
研究发现，同种血清型BTV毒株Seg-2之间，其序列也存在较大差异，并可根据这种差异，将同一血清型BTV的Seg-2分为东方地域型（Eastern topotype）和西方地域型（Western topotype）。构建的系统发生树显示，云南省分离的2株BTV-12型毒株（B139和B334）的Seg-2与南非BTV-12型毒株聚为一簇，序列相似度大于98.10%，属于Western地域型。云南省分离的BTV-1、-2、-3、-4、-15和-16型等毒株的Seg-2与分离自日本、印度和澳大利亚的同血清型毒株聚为Eastern地域型，其Seg-2序列相似度在89.03%~95.46%之间，VP2序列相似度在90.92%~98.30%之间；与同血清型Western地域型毒株的Seg-2序列相似度在68.00%~95.81%之间，VP2序列相似度在75.28%~97.14%之间（图1~2）。
Seg-3序列分析
Seg-3序列比对分析显示，本研究的25株BTV毒株间Seg-3核苷酸序列相似度在79.35%~93.93%之间，VP3氨基酸序列相似度在96.83%~99.95%之间（图2）。构建的Seg-3系统发生树显示，云南省分离的25株BTV毒株与来自中国台湾、澳大利亚和印度等地的毒株一同构成Eastern 地域型（图3）。本研究中的25株BTV与国外分离的Eastern地域型、Western 地域型和新血清型（BTV-25~28）毒株间Seg-3序列相似度在74.63%~89.29%之间，VP3序列相似度在88.69%~99.12%之间（图2）。在Eastern地域型内部，4株云南省分离的BTV-15型毒株与1株澳大利亚的BTV-15型毒株聚为相对独立的一簇，构成远东地域亚型（Far Eastern topotype）（图3），与Eastern 地域型其他毒株以及Western地域型、新血清型（BTV-25~28）毒株间的Seg-3/VP3序列相似度在75.18%~79.60%/88.20%~96.83%之间（图2）。这一方面表明云南省与澳大利亚的BTV-15型毒株Seg-3有着共同的起源，另一方面也表明该基因节段在进化上的相对独立性。
Seg-7序列分析
云南省不同血清型BTV毒株间Seg-7核苷酸序列相似度在73.85%~94.36%之间，VP7氨基酸序列相似度在85.96%~99.35%之间（图2）。Maan等的研究显示，BTV的Seg-7可分为3种东方地域亚型（Eastern topotype 1~3）和7种西方地域亚型（Western topotype 1~7）。云南省分离的21株BTV毒株的Seg-7分属Eastern topotype 1~3地域亚型，分别与来自中国台湾、日本、印度和澳大利亚等地毒株的Seg-7享有最近的亲缘关系（图4）。值得注意的是，云南省4株BTV的Seg-7属于Western地域型：云南省BTV-2型毒株（B238）和BTV-12型毒株（B139和B334）的Seg-7属于Western topotype 1地域亚型，与南非毒株具有最近的亲缘关系，序列相似度大于98.60%；BTV-16型（B034）毒株为Western topotype 3地域亚型，与荷兰毒株（GQ506478）和南非毒株（GQ506512）具有最近的亲缘关系，序列相似度均为95.60%（图4）。上述4株BTV毒株的Seg-7序列相似度在78.90%~100%之间，VP7序列相似度在94.60%~100%之间，而与云南省分离的Eastern 地域型毒株的Seg-7/VP7序列相似度分别在78.33%~79.07%/94.46%~95.74%之间（图2）。
Seg-10序列分析
云南省分离的25株BTV毒株的Seg-10核苷酸序列相似度在86.61%~94.68%之间，NS3氨基酸序列相似度在95.00%~99.08%之间（图2）。BTV毒株Seg-10系统发生树显示，该基因节段序列被划分为2个东方地域亚型（Eastern topotype 1~2）和3个西方地域亚型（Western topotype 1~3）（图5）。云南省分离的22株BTV毒株的Seg-10均属于Eastern topotype 1地域亚型，分别与来自中国台湾、日本、印度和澳大利亚等地毒株的Seg-10享有最近的亲缘关系（图5）。而3株云南省分离的BTV-15型毒株（B105、B358和B359）单独构成Eastern topotype 2地域亚型，与其他地域亚型毒株间Seg-10/NS3序列相似度则在76.93%~85.81%/83.41%~97.26%之间（图2、图5）。本研究中的25株BTV与Eastern topotype 1地域亚型内其他毒株、Eastern topotype 2地域亚型和Western地域型亚型毒株间的Seg-10序列相似度在77.02%~91.37%之间，NS3序列相似度在83.23%~97.55%之间（图2、图5）。
讨论
云南省复杂的地理环境和气候条件造就了该地区动物、植物和病毒的天然多样性。云南省地处我国边境地区，与越南、老挝和缅甸等多国接壤，家畜及畜产品贸易频繁，动物疫病跨境传播风险较高。多种血清型BTV在云南省广泛流行，说明该地区在我国BT防控中具有举足轻重的地位。过去认为BTV主要流行于南纬35?至北纬40?之间。但是，随着气候变暖、库蠓活动范围扩大和潜在传播虫媒种类增多，BT有逐渐向寒冷的高海拔和高纬度地区扩散的趋势，对我国北方地区的牛羊养殖业构成了威胁。掌握云南省1995—1997年BTV流行毒株的遗传背景，能够为分析我国BTV演化特征，进行病毒扩散与溯源分析提供宝贵的序列信息。
1995—1997年，本实验室在云南省分离出7种血清型BTV（BTV-1、-2、-3、-4、-12、-15和-16），2012年至今，在云南省哨兵动物中分离出11种血清型BTV（BTV-1、-2、-3、-4、-5、-9、-12、-15、-16、-21和-24），表明云南省流行的BTV血清型具有多样性。BTV-5、-9、-21和-24等4种血清型BTV在云南省的首次发现，提示我国可能还有其他血清型BTV存在，因此对我国流行BTV多样性的监测仍是一个长期的过程。病毒所处的生态环境不同，施加的选择压力不同，病毒的基因进化就会呈现出特定的地域特征。本研究发现，云南省流行的BTV毒株序列也呈现出特有的地域特征：云南省流行的BTV-15型毒株的Seg-3形成了独立于Eastern地域型和Western 地域型的进化分支（Far Eastern topotype），BTV-1和BTV-16型毒株的Seg-2也形成了独立的进化支系，BTV-15型毒株的Seg-10形成独立的Eastern topotype 2地域亚型，揭示了云南省流行的BTV在进化上的独特性。
Western 地域型BTV毒株侵入云南省后，在传播过程中与我国本地流行毒株发生了基因重配，与同属环状病毒属的流行性出血病病毒（epizootic hemorrhagic disease virus，EHDV）某些血清型间Seg-7较难发生重配不同，BTV毒株的Seg-7片段能够在自然环境中发生相对自由的重配，提示BTV进化可能主要由基因重配驱动，使病毒更适合在当地的生态系统中传播和生存。
本研究通过分析1995—1997年分离自云南省分属7种血清型的25株BTV毒株Seg-2、-3、-7和-10的遗传特征，发现云南省存在多种血清型BTV流行，既有本地长期流行的BTV-1型和BTV-16型毒株，也有Western 地域型BTV毒株侵入云南省后发生重配的毒株，提示我国BT防控形势十分严峻。本研究为分析我国BTV毒株的突变和基因重配提供了第一手资料，为追溯我国BTV毒株来源提供了依据。
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